produkty

Způsob, jakým se účinky simultánních mutací kombinují za účelem změny enzymatické aktivity, není snadno předvídatelný, protože tyto účinky nejsou vždy lineární aditivní.Charakterizace účinků simultánních mutací aminokyselinových zbytků, které se vážou na substrát, tedy může významně přispět k pochopení substrátové specifity enzymů.V beta-glykosidáze ze Spodoptera frugiperda (Sfbetagly) oba zbytky Q39 a E451 interagují se substrátem a to je zásadní pro definování substrátové specifity.Dvojité mutanty Sfbetagly (A451E39, S451E39 a S451N39) byly připraveny místně cílenou mutagenezí, exprimovány v bakteriích a purifikovány pomocí afinitní chromatografie.Tyto enzymy byly charakterizovány za použití p-nitrofenyl beta-galaktosidu a p-nitrofenyl beta-fukosidu jako substrátů.Poměr kcat/Km pro jednoduché a dvojité mutanty Sfbetagly obsahující místně cílené mutace v pozicích Q39 a E451 byl použit k prokázání, že vliv na volnou energii ESdouble dagger (komplex enzym-transition state) dvojitých mutací (Gdouble daggerxy) není součtem účinků vyplývajících z jednotlivých mutací (Gdouble daggerx a Gdouble daggery).Tento rozdíl v Gdouble dagger ukazuje, že účinky jednotlivých mutací se částečně překrývají.Tento společný efekt se tedy v Gdouble daggerxy počítá pouze jednou.Krystalografická data o beta-glykosidázách odhalují přítomnost bidentátní vodíkové vazby zahrnující zbytky Q39 a E451 a stejnou hydroxylovou skupinu substrátu.Termodynamická i krystalografická data tedy naznačují, že zbytky Q39 a E451 mají vzájemný vliv na jejich příslušné interakce se substrátem.