produkty

Pro specifickou kvantifikaci několika metabolitů 5-fluorouracilu (5-FU) a dvou endogenních monofosfátových nukleotidů jsme vyvinuli originální metodu založenou na kapalinové chromatografii – tandemové hmotnostní spektrometrii (LC-MS/MS).Tento test umožnil stanovení: (i) intracelulární produkce 5-fluor-2'-deoxyuridin-5'-monofosfátu (5-FdUMP) z 5-FU nebo 5-fluor-2'-deoxyuridinu (5-FdUrd) , (ii) dopad koncentrace 5-FdUMP na intracelulární poměr 2'-deoxyuridin-5'-monofosfát (dUMP)/thymidin-5'-monofosfát (TMP) a (iii) rozsah sekrece 5-FdUMP a 5-FU z lidských kultivovaných buněk transportéry ABC.Za našich experimentálních podmínek byly buňky inkubovány s 5-FU nebo 5-FUrd.Poté byly buněčné proteiny vysráženy methanolem.Tento postup poskytl vysoký výtěžek extrakce.Kromě toho jsme pro měření sekrece 5-FU a 5-FdUMP z buněk provedli kvantifikaci těchto molekul v kultivačním médiu.Média byla buď přímo injikována (5-FU), nebo byla provedena extrakce na pevné fázi pomocí extrakční patrony Oasis Wax (5-FdUMP).Separace analytů byla provedena na koloně dC18 Atlantis 3,5 μm, (100 mm × 2,1 mm id) s isokratickým režimem s použitím pufru mravenčan amonný/methanol/voda (5/5/90, obj./obj.) jako mobilní fáze.Doba běhu nepřesáhla 6,2 min.Analyty byly ionizovány v elektrosprejovém rozhraní v režimu negativních iontů.Metodu jsme validovali v rozsahu 2,5–150 ng ml -1 podle sloučenin.Variabilita v rámci testu a mezi testy byla nižší než 10 % během sedmi dnů.Všechny sloučeniny byly stabilní v buňkách nebo v kultivačním médiu, když byly vzorky skladovány při teplotě -20 °C po dobu alespoň dvou týdnů a po třech cyklech zmrazení a rozmrazení.V obou médiích nebyl pozorován žádný matricový efekt.