produkty

Nová metoda vysokoúčinné kapalinové chromatografie pro glykosyltransferázy založená na derivatizaci kyselinou anthranilovou a fluorescenční detekci.

Testy byly vyvinuty za použití jedinečné chemie značení kyseliny 2-aminobenzoové (2AA; kyselina anthranilová, AA) pro měření aktivit β1-4 galaktosyltransferázy (GalT-1) a α2-6 sialyltransferázy (ST-6) pomocí vysoce výkonné kapaliny chromatografie (HPLC) s fluorescenční detekcí (Anumula KR. 2006. Pokroky v metodách fluorescenční derivatizace pro vysokoúčinnou kapalinovou chromatografickou analýzu glykoproteinových sacharidů. Anal Biochem. 350:1-23).N-acetylglukosamin (GlcNAc) a N-acetyllaktosamin byly použity jako akceptory a uridindifosfát (UDP)-galaktóza a cytidinmonofosfát (CMP)-N-acetylneuraminová kyselina (NANA) jako donory pro GalT-1 a ST-6, v daném pořadí.Enzymatické produkty byly značeny in situ pomocí AA a byly separovány od substrátů na koloně TSKgel Amide 80 za podmínek normální fáze.Enzymové jednotky byly určeny z ploch píku srovnáním se současně derivatizovanými standardy Gal-pi-4GlcNAc a NANA-a2-6 Gal-pi-4GlcNAc.Pro testy byla stanovena linearita (čas a koncentrace enzymu), přesnost (intra- a intertest) a reprodukovatelnost.Bylo zjištěno, že testy jsou užitečné při monitorování enzymových aktivit během izolace a čištění.Testy byly vysoce citlivé a prováděly se stejně nebo lépe než tradiční měření na bázi radioaktivního cukru.Formát testu lze také použít pro měření aktivity jiných transferáz za předpokladu, že akceptory sacharidů obsahují redukující konec pro značení.Test na glykoproteinové akceptory byl vyvinut s použitím IgG.Pro separaci IgG glykanů (biantenárních G0, G1, G2, mono- a disialylovaných) byla vyvinuta krátká metoda HPLC profilování, která usnadnila rychlé stanovení aktivit GalT-1 a ST-6.Kromě toho by se tato metoda profilování měla ukázat jako užitečná pro sledování změn IgG glykanů v klinických podmínkách.