zprávy

IPTG (isopropyl-β-D-thiogalaktosid) je analog substrátu β-galaktosidázy, který je vysoce indukovatelný.Při indukci IPTG může induktor tvořit komplex s represorovým proteinem, takže konformace represorového proteinu je změněna, takže nemůže být kombinován s cílovým genem a cílový gen je účinně exprimován.Jak by se tedy měla během experimentu určit koncentrace IPTG?Je čím větší, tím lepší?
Nejprve pochopíme princip indukce IPTG: laktózový operon (element) E. coli obsahuje tři strukturní geny, Z, Y a A, které kódují β-galaktosidázu, permeázu a acetyltransferázu.lacZ hydrolyzuje laktózu na glukózu a galaktózu nebo na alo-laktózu;lacY umožňuje, aby laktóza v prostředí prošla buněčnou membránou a vstoupila do buňky;lacA přenáší acetylovou skupinu z acetyl-CoA na β-galaktosid, což zahrnuje odstranění toxického účinku.Kromě toho existuje operační sekvence O, výchozí sekvence P a regulační gen I. Kód genu I je represorový protein, který se může vázat na pozici O operátorové sekvence, takže operon (meta) je reprimován a vypnutý.Existuje také vazebné místo pro vazebné místo katabolický genový aktivátor protein-CAP upstream od iniciační sekvence P. Sekvence P, O sekvence a vazebné místo CAP společně tvoří regulační oblast lac operonu.Kódující geny těchto tří enzymů jsou regulovány stejnou regulační oblastí, aby se dosáhlo koordinované exprese genových produktů.

V nepřítomnosti laktózy je lac operon (meta) ve stavu represe.V tomto okamžiku se lac represor exprimovaný sekvencí I pod kontrolou sekvence promotoru PI váže na sekvenci O, což brání RNA polymeráze ve vazbě na sekvenci P a inhibuje iniciaci transkripce;když je přítomna laktóza, může být indukován lac operon (meta) V tomto operonovém (meta) systému není skutečným induktorem samotná laktóza.Laktóza vstupuje do buňky a je katalyzována β-galaktosidázou, aby se přeměnila na alolaktózu.Ta se jako induktorová molekula váže na represorový protein a mění konformaci proteinu, což vede k disociaci represorového proteinu od O sekvence a transkripci.Isopropylthiogalaktosid (IPTG) má stejný účinek jako allolaktosa.Jedná se o velmi silný induktor, který není metabolizován bakteriemi a je velmi stabilní, proto je široce používán v laboratořích.

Jak určit optimální koncentraci IPTG?Vezměte si jako příklad E. coli.
Geneticky upravený kmen E. coli BL21 obsahující pozitivní rekombinantní pGEX (CGRP/msCT) byl naočkován do kapalného média LB obsahujícího 50 ug.mL-1 Amp a kultivován přes noc při 37 °C.Výše uvedená kultura byla naočkována do 10 lahviček s 50 ml čerstvého kapalného média LB obsahujícího 50 ug.mL-1 Amp v poměru 1:100 pro expanzní kulturu, a když hodnota OD600 byla 0,6~0,8, přidal se IPTG do konečné koncentrace.Je to 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0 mmol.L-1.Po indukci při stejné teplotě a ve stejnou dobu byl z ní odebrán 1 ml bakteriálního roztoku a bakteriální buňky byly shromážděny centrifugací a podrobeny SDS-PAGE, aby se analyzoval vliv různých koncentrací IPTG na expresi proteinu. vyberte koncentraci IPTG s největší expresí proteinu.
Po experimentech se zjistí, že koncentrace IPTG není tak velká, jak je to možné.Je to proto, že IPTG má určitou toxicitu pro bakterie.Překročení koncentrace buňku také zabije;a obecně řečeno doufáme, že čím více rozpustného proteinu exprimovaného v buňce, tím lépe, ale v mnoha případech, kdy je koncentrace IPTG příliš vysoká, se vytvoří velké množství inkluze.Tělo, ale množství rozpustných bílkovin se snížilo.Proto často není nejvhodnější koncentrace IPTG čím větší, tím lepší, ale čím nižší je koncentrace.
Účelem indukce a kultivace geneticky upravených kmenů je zvýšit výtěžek cílového proteinu a snížit náklady.Exprese cílového genu není ovlivněna pouze vlastními faktory kmene a expresním plazmidem, ale také dalšími vnějšími podmínkami, jako je koncentrace induktoru, teplota indukce a doba indukce.Obecně tedy platí, že předtím, než je neznámý protein exprimován a purifikován, je nejlepší studovat indukční dobu, teplotu a koncentraci IPTG, aby bylo možné vybrat vhodné podmínky a získat nejlepší experimentální výsledky.