produkty

Fosforylace proteinů reguluje různé buněčné funkce a hraje klíčovou roli v raném vývoji rostlin.Abychom doplnili a rozšířili předchozí výzkumy fosforylace proteinů u semenáčků Arabidopsis, použili jsme alternativní přístup, který kombinuje extrakci proteinu za nedenaturačních podmínek s imobilizovanou afinitní chromatografií na kovech (IMAC) obohacením o neporušené fosfoproteiny v extraktech ochuzených o Rubisco, následovanou identifikací za použití dvourozměrné gelové elektroforézy (2-DE) a kapalinové chromatografie-tandemové hmotnostní spektrometrie (LC-MS/MS).Štěpení trypsinem v gelu a analýza vybraných gelových skvrn identifikovala 144 fosforylovaných peptidů a zbytků, z nichž pouze 18 fosfopeptidů a 8 fosfositů bylo nalezeno v databázích fosforylačních míst PhosPhAt 4.0 a P3DB Arabidopsis thaliana.Více než polovina z 82 identifikovaných fosfoproteinů se podílela na metabolismu sacharidů, fotosyntéze/respiraci nebo mechanismu reakce na oxidativní stres.Zdá se, že obohacení intaktních fosfoproteinů před 2-DE a LC-MS/MS zlepšuje detekci fosforylovaných threoninových a tyrosinových zbytků ve srovnání s metodami, které využívají obohacení na úrovni peptidů, což naznačuje, že tyto dva přístupy se poněkud doplňují, pokud jde o pokrytí fosforylačních míst.Porovnání výsledků pro mladé sazenice s výsledky získanými dříve pro zralé listy Arabidopsis identifikovalo pět proteinů, které jsou v těchto tkáních odlišně fosforylovány, což prokazuje potenciál této techniky pro zkoumání dynamiky fosforylace proteinů během vývoje rostlin.