produkty

Analýza fosforylačních událostí v celém proteomu je stále hlavní analytickou výzvou kvůli obrovské složitosti sítí fosforylace proteinů.V této práci hodnotíme komplementaritu Lys-N, Lys-C a trypsinu s ohledem na jejich schopnost přispět ke globální analýze fosfoproteomu.K účinné separaci N-koncově acetylovaných, fosforylovaných a nemodifikovaných peptidů byla použita rafinovaná verze silné kationtové výměny s nízkým pH.Celkem 5036 neredundantních fosfopeptidů bylo identifikováno s mírou falešného objevu <1 % z 1 mg proteinu pomocí kombinace tří enzymů.Naše data odhalila, že překrývání mezi soubory fosfopeptidových dat vytvořených s různými proteázami bylo marginální, zatímco bylo zjištěno, že překrývání mezi dvěma podobně generovanými soubory tryptických dat je alespoň 4krát vyšší.Tímto způsobem paralelní použití Lys-N a trypsinu umožnilo 72% zvýšení počtu detekovaných fosfopeptidů ve srovnání s d se samotným trypsinem, zatímco experiment s replikací trypsinu vedl pouze k 25% zvýšení.Když se tedy zaměříme pouze na data trypsinu a Lys-N, identifikovali jsme 4671 neredundantních fosfopeptidů.Další analýza detekovaných míst ukázala, že soubory dat Lys-N a trypsin byly obohaceny o výrazně odlišné fosforylační motivy, což dále dokazuje, že multiproteázové přístupy jsou velmi cenné při analýzách fosfoproteomů.